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無內毒素質粒DNA大量提取試劑盒(N1051)

價格: 1560.00
運費 ¥0.00
N1051(10次)

無內毒素質粒DNA大量提取試劑盒(硅膠膜離心柱法)

 

產品組分

 

貨號

N105110次)

RNase A10 mg/ml

600 μl×2


溶液

100 ml


溶液

100 ml


溶液

120 ml


溶液PB

120 ml


溶液PX

120 ml


溶液W

40 ml


溶液Eluent

20 ml


DNA純化柱

10


說明書

1



溶液W初次使用前用無水乙醇按1: 1.5稀釋,即含60%

乙醇。

溶液、溶液、溶液PB中含堿和變性劑,請不要直接

接觸皮膚。

上述產品組分均可單獨購買,詳見產品索引。

產品說明

本產品采用了經典的硅膠膜及堿裂法技術,用于轉染級質粒DNA的大量提取。純化原理是堿裂解細菌后,硅膠膜柱高效可逆地吸附體系中的質粒DNA(高鹽、低pH值),蛋白及其它雜質不被吸附而被除去,被吸附的質粒DNA在低鹽、高pH值條件下再被洗脫純化出來。同時,配有高效的內毒素去除液,確保所獲質粒DNA中無內毒素污染。一次可從100 ml過夜培養的菌液中純化得到400-1000 μg高純度轉染級質粒DNAOD260/280=1.7-1.9),此質粒DNA可直接用于用于多數細胞的轉染實驗。

 

質量控制

從大腸桿菌提取pGEM質粒DNA。提取的質粒DNA質量通過瓊脂糖凝膠電泳、限制性酶切和序列測定分析。

 

保存條件

RNase A:可室溫保存1年以上,低溫可長期保存。RNase A為渾濁溶液。初次使用本試劑盒時,請將RNase A全部加入到溶液中,均勻混合后于4℃保存。可保存6個月。

其他試劑:室溫保存。

若溶液出現沉淀,請于37℃保溫溶解。待恢復至室溫后使用。沉淀的出現不會影響質粒DNA的純化結果。

 

注意事項--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

溶液Ⅰ在使用前先加入RNase A(將試劑盒中提供的RNase A全部加入),混勻后4℃保存,可保存6個月。

溶液W第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明加入無水乙醇,即40 ml溶液W中加入60 ml無水乙醇,用后立即蓋緊蓋子。

若溶液Ⅱ出現沉淀,請于37℃保溫溶解,待恢復至室溫后使用。沉淀的出現不會影響質粒DNA的純化結果。

注意不要直接接觸溶液Ⅱ和溶液Ⅲ,使用后立即蓋緊蓋子。

提取的質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10 kb 的大質粒,應加大菌體使用量。高拷貝質粒推薦使用量為100ml,得率一般在0.5 mg~1.5 mg 左右;低拷貝質粒推薦使用量為200ml,得率一般在200~400μg 。溶液Eluent 應在65℃水浴預熱,在吸附和洗脫時可以適當的延長時間,以增加提取效率。其它步驟相同。

本產品適用于革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌中的質粒DNA提取。由于革蘭氏陽性菌外被一層較厚的細胞壁,會嚴重影響堿裂解細菌細胞的效率。因此,必須在堿裂解細胞前用溶菌酶(N9021)消化細胞壁。處理方法為:離心收集適量菌體,棄上清,加入250 μl溶液Ⅰ,充分振蕩懸浮菌體。加入溶菌酶使其終濃度為10-20 mg/ml左右,37℃處理30min。溶菌酶的濃度和處理時間可根據菌株的不同與具體的實驗條件加以調整。

所有離心步驟均為使用常規臺式離心機室溫下進行離心,速度為8,000 rpm(約8,228×g)。

請嚴格遵照操作步驟操作。

操作步驟--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

收集100 ml菌液。8,000 rpm離心5min,棄上清。盡量吸除上清,為確保上清液全部吸取,請倒置在干凈的吸水紙上。

   ●  應根據所培養菌體的濃度與拷貝數確定收集的菌液量。如果菌液濃度過低或低拷貝質粒,可收集2100 ml菌液并將菌體沉淀收集到一個離心管中。菌體的體積與質粒拷貝數參見注意事項。

加入7.5 ml溶液Ⅰ/ RNase A混合液,漩渦劇烈振蕩直至菌體重新懸浮。室溫靜置5-10min

   ●  初次使用本試劑盒時,請將RNase A全部加入到溶液中,均勻混合后于 4保存。可保存6個月。

●  不要殘留細小菌塊。菌體懸浮充分與否將決定質粒DNA得率的高低。

  ●  室溫靜置1-2 min是為使溶液中的RNA被充分降解。

加入7.5 ml溶液Ⅱ,輕柔地反復顛倒混勻12次。室溫放置3-5min,使菌體充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液。

   ●  若溶液出現沉淀,請于37保溫溶解。待恢復至室溫后使用。沉淀的出現不會影響質粒DNA的純化結果。

    ●  不可劇烈混和,否則會使染色體DNA斷裂。

   ●  此步驟不宜超過5 min

加入10 ml溶液Ⅲ。立即輕柔地反復顛倒混勻6-10次,此時會出現白色絮狀沉淀。

   ●  加入溶液Ⅲ后,應立即混勻避免產生局部沉淀。

5  8,000 rpm室溫離心12min,收集上清。

將上清置于DNA純化柱中,靜置5 min

    ●  如果收集的上清液過多,超過DNA純化柱容積(15 ml),可將上清分次加入DNA純化柱中。

7  8,000 rpm 離心2min,棄濾液。

     此時質粒DNA被吸附于DNA純化柱中的硅膠膜上。

加入10 ml 溶液PB8,000 rpm 離心2 min,棄濾液。

    ●  此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質洗脫,以獲得高質量質粒DNA

加入10 ml溶液PX8,000 rpm 離心2min,棄濾液。

    ●  此步驟可去除溶液中的內毒素

10  加入10 ml溶液W8,000 rpm 離心2 min,棄濾液。

11  加入10 ml溶液W8,000 rpm 離心2 min,棄濾液。

12  8,000 rpm離心4min,以去除純化柱中殘留的液體。打開純化柱的管蓋,室溫放置5min,將純化柱充分晾干。

     ●  此步驟的作用是去除殘余酒精,避免降低質粒的生物學活性,影響下游酶促反應。

13  DNA純化柱置于新的50 ml離心管中。向純化柱中央處,懸空滴加1.5-2 ml溶液Eluent65℃預熱),室溫放置5min

8,000 rpm離心2min。管底即為高純度質粒DNA。質粒DNA置于-20℃保存。

     ●  溶液Eluent可用無菌雙蒸水代替,但其pH需為8.0-8.5,加入體積視質粒拷貝數多少、用戶對質粒濃度要求而定。對溶液Eluent

      ●  65℃預熱,會提高提取質粒的產量。


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