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FS Mix Direct for tissue(P2071b-P2072b)

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P2071b(1ml(40次,50ul體系/次)) P2072b(1ml*5(200次,50ul體系/次))

FS? Mix Direct for Tissue

Cat. #P2071b,P2072b

產品簡介

FS? Mix Direct for Tissue是適合組織樣本擴增的濃縮快速高效PCR預混合溶液,含有FS? Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、緩沖液等PCR擴增必需組分(模板與引物除外)。使用時,僅需在擴增體系中加入簡單處理后的樣本處理液和引物即可進行PCR,從而可以極大地簡化操作過程,縮短操作時間,降低污染(加樣次數減少)。FS? Mix Direct for Tissue的反應體系經過優化處理,高靈敏度的FS? Taq DNA聚合酶確保處理液中的微量樣本得到高效擴增。本產品不用進行繁瑣的DNA提取,最大限度減少實驗誤差和交叉污染;同時依靠特殊的緩沖體系增強PCR擴增的特異性,保證擴增效果與DNA模板擴增效果同樣可靠。

FS? Taq DNA聚合酶是根據蛋白工程原理,以Taq DNA聚合酶為基礎,研發設計的新一代DNA聚合酶。本產品具有類似KOD酶的快速擴增能力,延伸速度為20s/kb70~75℃,簡單模板可達5s/kb)。是普通Taq DNA聚合酶的3倍,可縮短一半以上的擴增時間;同時具備Taq DNA聚合酶擴增效率高、適應性廣等優點。FS? Taq DNA聚合酶使用方法與普通Taq DNA聚合酶基本相同,只需注意適當縮短延伸時間。該酶具有5'→3'聚合酶活性,無3'→5'外切酶活性。擴增產物具有3'-dA突出端,可直接用于TA克隆。

產品組成

Component

P2071b

P2072b

2× FS? Mix   Direct for Tissue

1 ml

1 ml× 5

超純水

1 ml

1 ml× 5

Neutralization    Solution  

1 ml

5 ml

Extraction    Solution    

10   ml

40   ml

本產品分體系中包含溴酚藍、不含溴酚藍兩類。體系中包含溴酚藍的產品,PCR擴增產物可直接電泳檢測。這兩類產品的擴增性能無差異。如無特別說明提供體系中包含溴酚藍的包裝。

保存條件

-20℃保存2年。

質量控制

純度檢測:經質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測:PCR方法檢測無宿主殘余DNA,能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。

應用舉例

1. 處理樣品

組織:3-5mg組織置于1.5ml離心管中,加入180 μl Extraction Solution,充分渦旋振蕩,95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization Solution,充分渦旋振蕩,5,000rpm離心2min,取0.5-2 μl上清進行擴增。

頭發:取兩根帶毛囊的頭發,剪下帶毛囊的發根放入1.5ml離心管中,加入180 μl Extraction Solution,充分渦旋振蕩,95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization Solution,充分渦旋振蕩,5000rpm離心2min,取0.5-2 μl上清進行擴增。

口腔拭子:取樣前30min內請勿進食及飲水,使用無菌棉簽在口腔內擦拭10次。將棉球剪下置于1.5ml離心管中,加入180 μl Extraction  Solution,充分渦旋振蕩,95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization Solution,充分渦旋振蕩,5,000rpm離心2min,取0.5-2 μl上清進行擴增。

培養細胞:如果是懸浮培養細胞直接取1×103-104當量的細胞加入到50 μl PCR反應體系中即可。如果是貼壁培養細胞,取3-5mg細胞組織置于1.5ml離心管中,加入180 μl Extraction Solution,充分渦旋振蕩,95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization Solution,充分渦旋振蕩,5,000rpm離心2min,取0.5-2 μl上清進行擴增。

血液、淋巴液DNA病毒:100 μl血清或淋巴液至1.5ml離心管中,加入180 μl Extraction Solution,充分渦旋振蕩,95℃溫浴10min。加入20 μl Neutralization  Solution,充分渦旋振蕩,12,000rpm離心10min,取0.5-2 μl上清進行擴增。

2. 配制反應體系

請于冰上配置反應體系,體系大小與組分用量與添加順序可調整:

Ordinal

Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)

1

2× FS? Mix   Direct for Tissue

25   μl

2

upstream   primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4   μM

3

downstream   primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4   μM

4

處理液上清

0.5-2   μl

<1μg

5

超純水[2]

To 50   μl

-

optional

MgCl2(MgSO4)/PCR   Enhancer[3]

Variable

-

[1] 引物終濃度建議范圍:0.1-1 μM。特異性差時可降低濃度,效率低時可提高濃度。

[2] 可單獨訂購超純水(Cat. #P9021/P9022/P9023)。

[3] 可單獨訂購25mM MgCl2Cat. #P9031)和PCR EnhancerCat. #P9041)。

3. 設定反應程序進行PCR反應

大多數模板的快速擴增條件:

Stage  

Temperature

Time

Number   of Cycles

Initial   Denaturation

94℃

3   min

1

Denaturation

94℃

30   sec

28-40  

Annealing

55-68℃[1]

30   sec

Extension

72℃

Variable[2]

Final   Extension

72℃

2   min

1

[1] 退火溫度應根據Tm值較低的引物來設。

[2] 延伸時間按20 sec/kb來設最佳。

1kb簡單模板的快速擴增條件:

由于1kb簡單模板的二級結構簡單,且長度較短,可同時縮短變性、退火時間至15s,延伸時間20s,以實現快速擴增。

4. 分析結果

反應產物可直接進行瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。如有需要,可進行割膠回收。無產物或產物量少的改進措施有:1調整退火溫度;2減少抑制劑的影響,如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分,需要高倍稀釋(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脫,提高模板DNA的純度;4使用PCR添加劑,如PCR EnhancerCat. #P9041、MgCl2Cat. #P9031等可提高產量。

操作注意事項

處理的組織樣本往往不會完全溶解,這是正?,F象。溶解在處理液中的組織樣本足夠滿足FS? Mix Direct for Tissue擴增的需要。

室溫下FS? Taq DNA聚合酶有一定的活性,為避免發生非特異性擴增,請于冰上配置反應體系,并且最后添加模板DNA。

延伸時間視片段長度而定。一般情況,≤500bp目的片段延伸15s,500bp-1kb延伸20s,>1kb延伸時間按20s/kb計算。

FS? Taq DNA聚合酶具有脫氧核苷酸轉移酶活性,因此在PCR產物3’末端通常會加上一個多余的脫氧腺嘌呤核苷,可進行TA克隆。

FS? Mix Direct for Tissue也可采用常規程序擴增。

引物設計注意事項

引物長度一般在15-30個堿基之間;上下游引物3’末端避免互補,避免出現3個以上重復的GC,或出現發夾結構,否則會產生非特異性擴增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量盡量接近;Tm值控制在55-65℃之間,且上下游引物Tm值盡量接近,額外附加序列(酶切位點、修飾等)是非模板匹配序列,不參與Tm值計算。

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名稱

貨號

規格

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